pcr过程:融合PCR的操作原理及注意事项

目录1.融合PCR的操作原理及注意事项2.PCR技术基本原理3.PCR技术具体的过程4.pcr技术变性过程是通过什么的作用来完成的5.PCR技术基本原理及反应步骤？马上就要考试了~6.何谓PCR，包括哪些步骤7.PCR反应过程示意图1.融合PCR的操作原理及注意事项PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。实验操作注意事项1、戴一次性手套,若不小心溅上反应液,严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中,3、避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面。4、操作多份样品时，制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,可以增加反应的精确度。5、最后加入反应模板，6、操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性,又可以协助判断扩增系统的可信性。7、尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。至少PCR操作过程中加样器应该专用,尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区。扩展资料融合PCR技术( fusion PCR)采用具有互补未端的引物，形成具有重叠链的PCR产物。2.PCR技术基本原理一、PCR技术基本原理有：1、PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。2、PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，以便它与引物结合，②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍，是能将微量的DNA大幅增加，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，1、PCR产物的生成量是以指数方式增加的：3.PCR技术具体的过程PCR技术（聚合酶链式反应）由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，按碱基配对与半保留复制原理。4.pcr技术变性过程是通过什么的作用来完成的PCR技术的基本原理 ⑴PCR技术的基本原理：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，沿模板5´合成一条新的DNA互补链。PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，半保留复制链”而且这种新链又可成为下次循环的模板，每完成一个循环需2～4分钟。2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍，⑵PCR的反应动力学。PCR的三个反应步骤反复进行：使DNA扩增量呈指数上升，反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数。X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数，平均扩增效率的理论值为100%。但在实际反应中平均效率达不到理论值，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素”⑶PCR扩增产物，可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'：是需要扩增的特定片段;5.PCR技术基本原理及反应步骤？马上就要考试了~PCR技术的基本原理 ⑴PCR技术的基本原理：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。⑵PCR的反应动力学： PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。⑶PCR扩增产物 ：可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中， 以两条互补的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸， 其5'端是固定的，3' 端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时， 由于新链模板的5'端序列是固定的， 这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点， 保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加， 而“长产物片段”则以算术倍数增加， 几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。6.何谓PCR，包括哪些步骤PCR分普通PCR和定量PCR,是需要先抽提RNA，然后逆转录成cDNA，再开始定量PCR反应。所谓的一步法，就是把逆转录这个过程，放在一起完成了。7.PCR反应过程示意图聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异 DNA片段的一种方法，典型的 PCR 由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。将待扩增的模板 DNA 置高温下（通常为 93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合。